釀酒酵母是巨噬酵母公認的有益於人類的真菌，在營養條件充足的细胞情況下它進行有絲分裂，此時的识别酵母以營養態細胞狀態存在。但是酿酒，在碳源或氮源等營養條件匱乏的研究情況下，釀酒酵母為了傳宗接代，巨噬酵母會進行減數分裂，细胞產4個孢子包裹於子囊中。识别營養態酵母細胞壁有兩層，酿酒分別是研究內層葡聚糖層和外層的甘露糖蛋白層。酵母孢子壁有4層，巨噬酵母從內到外依次是细胞甘露糖層、葡聚糖層、识别殼聚糖層和二酪氨酸層。酿酒二酪氨酸層是研究酵母孢子壁特有的結構，其單體是由兩個甲基酪氨酸分子構成。這種特殊的孢子壁結構能幫助減數分裂後的細胞核抵禦嚴酷的大自然環境，等待適宜的生長環境，從而發芽成長，再次成為營養細胞形態，維持酵母的繁衍。
巨噬細胞屬於免疫細胞的一種，能夠吞噬和降解外源顆粒以及微生物並激活免疫反應。巨噬細胞的吞噬過程依賴於細胞表麵的模式識別受體，該受體能夠識別微生物表麵保守的分子模式並且激活受體上酪氨酸基序。被激活的ITAM序列進一步招募脾酪氨酸激酶啟動巨噬細胞的吞噬過程。Svk信號能夠激活諸如磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶等下遊信號，從而增加吞噬效率。吞噬過程中，較大顆粒(＞2μm)吞噬依賴於P13K的活性。巨噬細胞對微生物表麵分子模式的識別是啟動直接吞噬的第一步。微生物表麵的糖鏈結構的特殊性使其被巨噬細胞所識別從而引起吞噬。
自然條件下，多數酵母處於營養細胞態。營養態酵母壁的葡聚糖成分能夠被巨噬細胞表麵葡聚糖受體識別從而引起吞噬，促進巨噬細胞炎症因子TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的釋放，葡聚糖也能夠與細菌結合從而抑製細菌在胃腸道增殖從而達到抑菌的作用。營養態酵母壁的幾丁質成分也能刺激巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α和IL-6，並且增強巨噬細胞對假絲酵母的殺傷作用圈。營養態酵母壁上這些免疫活性物質的存在使得營養態酵母作為飼料添加物能夠增強牛和豬的免疫力。
釀酒酵母雖為與人類共生的真菌，但目前其子囊孢子形態對免疫係統的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖層被殼聚糖層和二酪氨酸層嚴密包裹。其免疫活性物質未知。作者以小鼠RAW264.7細胞作為巨噬細胞模型，研究了巨噬細胞識別和吞噬酵母孢子的作用機製，為後續探究野生型酵母孢子免疫作用提供參考。
作者使用高效產孢率的AⅣJ2D二倍體釀酒酵母菌株，以及ditl△和hs3△突變體菌株，均來自作者所在實驗室保藏菌株，相關信息見表1。
RAW264.7小鼠巨噬細胞，購自中科院菌種保藏庫，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養基培養，條件為5％CO2，37℃。
YPAD培養基：蛋白腖A10g，酵母提取物5g，腺嘌呤15mg溶解於450mL去離子水中，滅菌後加入50mL質量濃度為20g/dL的葡萄糖混勻。固體培養基則加入瓊脂(Agar)10g一起滅菌，之後加入葡萄糖混勻，倒平板。
YPAce培養基：蛋白腖A20g，酵母提取物10g，腺嘌呤30mg，醋酸鉀10g溶解於lL去離子水中，高壓濕熱滅菌。
KAc培養基：稱取20gKAc溶於1L去離子水中，固體培養基加入20g的瓊脂粉，高壓滅菌，倒平板。
主要試劑有：DMEM高糖培養基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，昆布糖(Sigma)，葡聚糖微球(Sigma)，PBS(生工)，胰蛋白酶(生工)，蛋白酶K(Sigma)，溶菌酶(Sigma)；主要儀器有：細胞培養箱(Thermo)，離心機(Takara)，顯微鏡(日立)等。
酵母菌株於固體YPAD平板劃線培養3d後，用粗頭牙簽接種於5mLYPAD液體培養基，轉接於100mL液體YPAD培養基培養3～5h，使酵母處於對數生長期並且0D660為0.6～0.8，此時收集營養態酵母，用0.5％吐溫-20洗3次後再用去離子水洗3次，3000r/min離心，稱質量備用。酵母孢子的製備：營養態酵母過夜培養後，取10mL轉接到200mL的YPAce培養基中，培養12h後離心轉移到2％KAc培養基後續培養2d；離心收集子囊酵母，當產孢率大於95％時，離心收集菌體，PBS洗2次，加入5mL原生質體溶液(1.2mol/L山梨醇，0.1mol/LPBS)和50μL(10OOOU/mL)溶菌酶，於25℃搖床處理3h；原生質體溶液洗2次，去離子水洗2次，加入5mL去離子水超聲20min(45％功率，超聲5s，停2s)，用0.5％吐溫-20洗3次後再用去離子水洗3次。顯微鏡觀察孢子純化效果，將純化後孢子製備成100mg/mL的孢子懸液。
RAW264.7小鼠巨噬細胞置於含10％滅活牛血清的DMEM高糖培養基培養，用含EDTA的胰酶消化後傳代。12孔板每孔接種5×105個細胞，培養24h後，每孔加入相同質量的營養態酵母或者酵母孢子，每組設置5個平行，1300r/min離心3min，使酵母落到細胞表麵，後續培養30min，PBS洗3次，胰酶消化收集細胞於離心管，4％多聚甲醛同定10min，PBS洗3次。顯微鏡鏡檢並統計每100個巨噬細胞吞噬營養態酵母或孢子的個數。
用培養基將母液濃度為10mmol/L的Svk抑製劑白皮杉醇稀釋為25μmol/L或50μmol/L的工作濃度；用培養基將母液質量濃度為lmg/mL的P13K抑製劑渥曼青黴素稀釋為100ng/mL或200ng/mL。進行抑製實驗時，細胞接種於12孔板培養24h，更換為含有白皮杉醇或渥曼青黴素的培養基並於37℃孵育30min，加入1mg營養態酵母或lmg酵母孢子或200μg葡聚糖微球，離心並後續培養30min，統計相對吞噬效率。
營養態酵母或孢子與巨噬細胞共培養前，更換不含血清的DMEM高糖培養基或含有10％血清的培養基處理2h，隨後更換為處理組對應的培養基並分別加入lmg的營養態酵母或酵母孢子，l300r/min離心2min後共培養30min，統計吞噬效率。
1.9高鹽以及蛋白酶處理對孢子吞噬效率的影響
野生型酵母孢子經高鹽(0.6mol/LNaCl或1mol/LPBS)洗滌後，去離子水洗3次，離心稱質量。蛋白酶處理野生型酵母孢子時，取野生型酵母孢子100mg，按照以下反應進行：50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/LCaCl2，加入200μL蛋白酶K(600U/mL)，於37℃處理1h。之後用0.5％吐溫-20洗滌3次，去離子水洗滌3次，超聲30s，製備成100mg/mL的孢子懸液。比較處理組與未處理組吞噬效率。
相關鏈接：腺嘌呤，蛋白腖，蛋白酶K，胎牛血清
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